抑制控制是一种关键的执行功能，使动物能够抑制冲动行为以实现特定目标或避免惩罚。研究人员通过荧光传感器测量去甲肾上腺素和乙酰胆碱的细胞外水平，在小鼠执行抑制控制任务时同步记录了前额叶皮层中这两种神经递质的动态变化。前额叶去甲肾上腺素与乙酰胆碱信号在0.4-0.8赫兹频段呈现显著相干性。神经追踪研究显示，虽然抑制投射至前额叶皮层的蓝斑神经元会损害抑制控制，但抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元会导致更严重的功能障碍——尽管这两类神经元存在约30%的重叠。抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元并未改变成功与失败试验中前额叶去甲肾上腺素/乙酰胆碱信号的差异，而是消除了成功与失败试验中去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性的差异，表明这种相位同步是具有任务相关性的神经调节特征。对投射至蓝斑区域的胆碱能神经元进行化学遗传学抑制既不影响抑制控制，也未消除成功与失败试验中去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性的差异，进一步证实了该同步性与抑制控制的相关性。为探究去甲肾上腺素-乙酰胆碱同步对前额叶群体活动的影响，研究人员采用Neuropixels探针在抑制控制过程中记录前额叶皮层活动。通过解混主成分分析发现，抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元不仅减少了编码抑制控制的前额叶神经元数量，更破坏了表征抑制控制的群体放电模式。这些发现表明，蓝斑通过其与胆碱能系统对前额叶群体活动的协同作用来调节抑制控制。研究结果进一步揭示，去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步是一种关键的神经调节特征，对认知控制具有重要影响。
展开剩余97%一、介绍
无论是在感恩节餐桌上进行政治讨论时"咬住舌头保持沉默"，还是在棒球比赛中放弃击打坏球，这种为实现特定目标而抑制不当行为的能力，是人类执行功能的关键要素。抑制控制使动物能够抑制冲动行为直至条件合适，从而避免不良后果。冲动性作为一种复杂的神经精神特征，通常表现为不经深思熟虑就贸然行动的倾向。学界普遍认为冲动行为源于"自上而下"抑制功能受损，这是物质使用障碍、注意缺陷多动障碍及反社会人格障碍等多种临床疾病的核心特征。
日益增多的研究表明，前额叶皮层是大脑冲动调控网络的核心节点，在抑制控制中起关键作用。多种神经递质系统对抑制控制等认知功能具有重要调节作用：多巴胺系统长期以来被认为与冲动控制相关，这得益于安非他明（多巴胺受体激动剂）和哌醋甲酯（多巴胺与去甲肾上腺素再摄取抑制剂）在治疗注意缺陷多动障碍冲动症状中的显著疗效；近期临床前和临床研究进一步揭示了去甲肾上腺素能与胆碱能系统在抑制控制中的作用。例如研究人员发现，选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂阿托莫西汀能显著提升大鼠在各种冲动行为测试中的冲动控制能力。
去甲肾上腺素与乙酰胆碱作为大脑中两种重要神经递质，主要通过容积传输方式作用于相应受体，调节多种感觉运动与认知功能。脑干去甲肾上腺素能核团蓝斑为整个前脑提供主要去甲肾上腺素输入，通过其广泛投射调节多种脑功能；基底前脑区胆碱能神经元则是皮层乙酰胆碱的主要来源。前额叶皮层同时接受密集的胆碱能与去甲肾上腺素能投射，其神经元共表达肾上腺素能与胆碱能受体，提示这两种神经递质可能通过竞争性细胞内信号通路发挥作用。然而，关于抑制控制过程中前额叶去甲肾上腺素与乙酰胆碱的动态变化规律，以及两者如何通过交互作用调节前额叶群体神经元活动进而影响抑制控制，目前尚不明确。
为解决这些问题，本研究通过荧光GRABNE和GRABACh传感器同步检测执行抑制控制任务小鼠的细胞外去甲肾上腺素与乙酰胆碱水平，揭示前额叶这两种神经递质在抑制控制过程中的动态变化。研究发现前额叶去甲肾上腺素与乙酰胆碱信号在抑制控制过程中保持动态相位关系，且更倾向于同相位波动。化学遗传学抑制投射至基底前脑区的蓝斑神经元会使行为表现降至随机水平，值得注意的是，该操作虽然未改变成功与失败试验中去甲肾上腺素/乙酰胆碱信号的差异，但消除了去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性的组间差异。而抑制投射至蓝斑的胆碱能神经元既未改变前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性，也不影响抑制控制表现。后续Neuropixels记录证实，抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元还会破坏表征抑制控制的群体神经动力学，提示去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步对神经活动具有调节作用。逆行追踪研究显示，投射至前额叶皮层与基底前脑的蓝斑神经元存在约30%重叠的不同亚群。
这些结果表明，前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步是一种新型神经调节特征，它通过调节群体神经元活动来介导抑制控制的神经调控过程。
二、结果
01.前额叶皮层去甲肾上腺素与乙酰胆碱水平的协同波动
为探究去甲肾上腺素能与胆碱能信号在抑制控制中的交互作用，研究人员通过AAV载体在小鼠前额叶皮层表达基因编码的荧光生物传感器GRABNE和GRABACh（图1a,b）。在行为训练初期，我们观察到随机给予糖水奖励时去甲肾上腺素与乙酰胆碱水平均出现瞬时升高，证实这些生物传感器具备监测行为相关神经活动的能力（图1c,d）。进一步分析发现，糖水奖励引发的乙酰胆碱瞬态响应幅度与去甲肾上腺素响应相当（图1e），但两者峰值响应潜伏期存在显著差异。大脑内去甲肾上腺素与乙酰胆碱水平均存在自发波动（图1f），且这两种神经递质的波动呈现显著相关性。互相关分析显示去甲肾上腺素与乙酰胆碱信号呈正相关，峰值相关系数达0.331±0.041（图1g）。与既往研究一致，去甲肾上腺素动态变化较乙酰胆碱提前0.03±0.01秒。相干性分析表明这两种神经调节信号在0.4-0.8赫兹频段呈现最大相关性，提示该频段存在强烈交互作用（图1h）。通过同步记录双侧前额叶皮层GRAB信号并进行互相关分析，发现同类GRAB信号在两侧半球的相关系数约为0.85，证实单侧半球信号能可靠反映对侧同类信号的变化。
图1. 前额叶皮层去甲肾上腺素与乙酰胆碱的自发波动
a) GRABNE与GRABACh记录示意图
b) 前额叶皮层GRABNE与GRABACh表达的组织学验证
c) 神经递质对水奖励响应的示例热图
d) 水奖励引发的去甲肾上腺素与乙酰胆碱动态变化（7只动物25次记录）
e) 水奖励引发的神经递质峰值响应（上）及潜伏期（下）
f) 同步记录的神经递质与瞳孔尺寸示例曲线（插图为信号频谱）
g) 神经递质信号互相关图（19只动物165次记录）
h) 神经递质信号相干性分析（19只动物165次记录）
i,j) 神经递质信号与瞳孔尺寸的互相关图（19只动物111次记录）
k,l) 神经递质信号与瞳孔变化速率的互相关图
m) 小鼠瞳孔示例图像（上）及神经递质信号与瞳孔波动的相位关系（下）
所有图示误差线或阴影区均表示标准误
既往研究证实瞳孔尺寸能够反映感觉皮层中去甲肾上腺素能与胆碱能轴突的活动。为探究瞳孔尺寸是否同样能追踪前额叶皮层中去甲肾上腺素与乙酰胆碱的波动，研究人员对瞳孔尺寸与GRABNE/GRABACh信号进行了互相关分析。结果显示瞳孔尺寸与两种神经递质信号均呈正相关，其中乙酰胆碱的峰值相关系数略高（图1i,j）。分析发现去甲肾上腺素与乙酰胆碱信号均领先于瞳孔波动，且去甲肾上腺素的领先时间更长，该结果与两种神经递质间的直接互相关分析一致。通过进一步分析神经递质信号与瞳孔变化速率的关系，发现虽然去甲肾上腺素和乙酰胆碱与瞳孔变化速率的相关系数峰值无显著差异，但乙酰胆碱的峰值潜伏期显著长于去甲肾上腺素（图1k,l）。通过将神经递质波动与希尔伯特变换提取的瞳孔收缩-扩张典型周期进行对齐，研究人员再次确认皮层去甲肾上腺素/乙酰胆碱信号与瞳孔尺寸的相关性。与既往发现一致，两种神经递质均在瞳孔相位为负值时达到峰值振幅，进一步证实神经递质信号变化先于瞳孔波动（图1m）。
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02.前额叶去甲肾上腺素与乙酰胆碱在抑制控制中的动态特征
在验证生物传感器功能基础上，研究人员重点考察了抑制控制过程中神经递质的动态变化。通过同步记录19只小鼠执行抑制控制任务时的前额叶神经递质信号（图2a），发现未经训练的小鼠在建立出水口-糖水关联后（通常首日即形成），即使糖水滴仅每12-22秒随机给予一次，仍会持续舔吸以寻找糖水，后续实验中升高的舔吸频率证实了这一习惯性行为（图2b）。在抑制控制任务中，小鼠需抑制冲动性舔吸。每轮试验开始时，动物可在自由期（5-7秒均匀分布）无惩罚自由舔吸；随后抑制提示音持续期间（时长按λ=4.5的指数分布从5-12秒随机选取），舔吸将触发短暂气流喷射并立即终止提示音，而成功抑制舔吸则会在提示音结束时获得糖水奖励。数据显示小鼠在提示音开始后能有效抑制冲动舔吸，且成功率在训练初期逐步提升，表明抑制控制是习得性行为（附图2a）。提示音开始后2秒内的舔吸频率显著低于提示音前2秒窗口（图2c, 附图2b），动物成功率显著高于随机水平（图2d, 附图2c）。随着抑制提示音时长增加（按5-7.5秒、7.5-10秒、10-12秒分组），小鼠抑制冲动舔吸的能力逐渐下降（图2e）。动物通常在500毫秒内获取水滴奖励（附图2d），抑制音时长对反应时间（从抑制音结束到首次奖励舔吸的间隔）无显著影响，表明动物在任务期间保持警觉状态（图2f）。这些行为结果共同说明动物在抑制控制任务中运用了认知控制来抑制冲动舔吸。
图2. 抑制控制期间前额叶去甲肾上腺素与乙酰胆碱动态变化
a) 抑制控制任务示意图
b) 训练初期冲动舔吸频率（13只动物52次记录）
c) 抑制音开始前后的舔吸示例点阵图（上）及平均舔吸频率（下）（30只动物260次记录）
d) 实际成功率与随机成功率对比
e) 不同抑制音时长对应的成功率
f) 不同抑制音时长对应的反应时间
g) 前额叶皮层失活前后的成功率（3只动物28次记录）
h) 前额叶去甲肾上腺素能输入失活前后的成功率（3只动物30次记录）
i) 前额叶胆碱能输入失活前后的成功率（5只动物44次记录）
j) 成功与失败试验中抑制音开始前后的神经递质动态（19只动物165次记录）
k) 抑制音开始前神经递质平均水平
l) 抑制音触发的神经递质瞬态响应峰值
m) 神经递质瞬态响应峰值潜伏期
n) 行为结果出现前的神经递质动态
o) 行为结果出现前的神经递质平均水平
p) 行为结果出现前神经递质信号斜率
q) 行为结果出现前神经递质信号波谷时间
r) 成功与失败试验神经递质信号分布的ROC曲线下面积
尽管先前药理学研究提示前额叶去甲肾上腺素在抑制控制中具有重要作用，我们首先通过化学遗传学方法验证前额叶皮层在本任务中的必要性。野生型小鼠前额叶皮层失活后，其抑制控制任务成功率显著下降（图2g），表明该脑区为任务执行所必需。接下来我们探究了前额叶去甲肾上腺素能与胆碱能信号在抑制控制中的作用。特异性失活前额叶去甲肾上腺素能输入导致成功率降低15.9%（图2h），而胆碱能输入失活则使成功率下降14.9%（图2i）。在确认这两种神经递质的必要性后，我们开始系统分析抑制控制过程中前额叶神经递质的动态特征。
与既往研究报道的蓝斑神经元对显著刺激的相位性放电一致，抑制提示音的呈现引发了前额叶去甲肾上腺素水平的相位性升高（图2j）。值得注意的是，乙酰胆碱浓度在提示音出现后也呈现显著上升。比较成功与失败试验发现，两种行为结果在抑制音出现前的神经递质水平无显著差异（图2k），诱发瞬态响应的峰值振幅与潜伏期在两组间也无统计学差异（图2l,m）。
鉴于抑制音出现前的神经递质动态与行为表现无关，我们进一步分析了行为结果出现前5秒时间窗内的神经递质变化。选择5秒窗口是因为这代表抑制音的最短持续时间，可涵盖所有成功试验。虽然两种神经递质信号在行为结果前总体呈下降趋势，但在失败试验中，冲动舔吸发生前约0.5秒均出现回升（图2n-p）。研究发现成功与失败试验的细胞外神经递质水平存在显著差异（图2o），但仅乙酰胆碱的下降斜率在两组间具有统计学差异（图2p）。去甲肾上腺素的波谷时间略早于乙酰胆碱（图2q）。通过ROC分析定量评估神经递质水平对行为结果的区分能力，发现乙酰胆碱的ROC曲线下面积显著大于去甲肾上腺素（图2r），提示乙酰胆碱动态对成功与失败结局的区分度更高。
支持向量机分类器分析结果与ROC分析一致：基于单试次乙酰胆碱动态的分类准确率显著优于去甲肾上腺素（附图4a）。此外，在抑制控制过程中，成功与失败试验的去甲肾上腺素-乙酰胆碱相关性无显著差异（附图4b）。
03.前额叶去甲肾上腺素或乙酰胆碱的动态变化均非抑制控制的可靠指标
上述结果表明前额叶两种神经递质水平均与抑制控制存在关联，但其在行为结果前的水平差异是否真正反映抑制控制功能？我们推测若确实如此，当抑制控制受损时，这种差异应减弱甚至消失。为验证该假设，研究人员通过化学遗传学方法调控行为小鼠的蓝斑-去甲肾上腺素系统。在DBh-Cre小鼠基底前脑区注射AAVrg-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry，逆向在投射至基底前脑的蓝斑神经元中表达抑制性DREADD受体（图3a）。组织学检测证实DREADD在蓝斑神经元的成功表达（图3b和附图5a）。对照组（生理盐水注射）小鼠的抑制控制表现显著高于随机水平（附图5b），与野生型小鼠相当（附图5c,d）。而给予CNO抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元后，小鼠行为表现急剧下降19.6%（图3c），且CNO组表现与随机水平无显著差异，表明其抑制控制功能完全受损。为排除CNO本身的影响，对4只野生型小鼠给予CNO/DCZ处理，发现其对抑制控制无显著影响（附图6a）。
图3. 化学遗传学抑制投射基底前脑的蓝斑神经元损害行为表现，但未消除成功与失败试验的神经递质信号差异
a) 逆向表达DREADD受体示意图
b) 蓝斑神经元DREADD受体表达的组织学验证
c) CNO介导的化学遗传学抑制使抑制控制表现降至随机水平
d,e) 该操作延缓反应时间但不改变自由期舔吸频率
f) 生理盐水与CNO处理下行为结果前的平均神经递质信号
g) 两种处理条件下成功与失败试验的神经递质信号轨迹
h,i) 成功与失败试验行为结果前的神经递质平均水平
j) 成功与失败试验神经递质水平差异的ROC曲线下面积
（所有数据来自5只动物的34次生理盐水记录和42次CNO记录）
尽管CNO处理延缓了小鼠的反应时间（图3d），但未显著影响自由期的舔吸频率（图3e）。有趣的是，CNO处理组与生理盐水对照组在行为结果前的神经递质动态未见显著差异（图3f）。CNO介导的蓝斑神经元抑制对抑制提示音或水奖励引发的前额叶神经递质动态仅产生轻微影响（附图6b,c）。由于CNO处理严重破坏了抑制控制功能，我们预期其会消除成功与失败试验间的神经递质水平差异。然而与预期相反，按行为结果分组分析发现：蓝斑神经元失活并未减弱两种神经递质在成功与失败试验间的差异，反而在抑制控制功能完全受损时，乙酰胆碱信号的组间差异呈现增强趋势（图3g-i）。这表明神经递质平均水平的差异并非抑制控制的可靠指标。ROC定量分析显示，乙酰胆碱信号的ROC曲线下面积显著增大，而去甲肾上腺素信号保持不变（图3j）。这些结果共同表明，神经递质的平均信号强度与抑制控制行为无稳定关联。支持向量机分析也显示，在蓝斑神经元被抑制后，基于乙酰胆碱信号的分类准确率仅有微弱提升且无统计学意义（附图4c）。
04.前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性是抑制控制的行为指标
既然神经递质平均水平与行为关联不稳定，我们转而探究其他潜在特征。鉴于两种神经递质系统在0.4-0.8赫兹频段相干性最强，我们首先考察该频段波动相位是否与抑制控制相关（图4a）。研究发现，CNO抑制蓝斑神经元并未消除成功与失败试验中乙酰胆碱与去甲肾上腺素相位分布的差异，表明单一信号相位同样与抑制控制无关（图4b）。通过细致观察神经递质波动，我们发现去甲肾上腺素与乙酰胆碱信号的相位关系具有动态特性：某些时段呈现同相位，而另一些时段则呈现反相位。通过计算相位编码值定量评估两种信号的相位同步性，发现CNO处理虽未改变行为结果前5秒内的总体相位同步水平（图4c），但成功与失败试验间的相位同步性在生理盐水组中于行为结果前3秒开始分化（图4d左），而CNO处理则完全消除了这种分化（图4d右，图4e）。与生理盐水组相比，CNO组的相位同步性ROC曲线下面积显著降低（图4f）。考虑到乙酰胆碱信号滞后于去甲肾上腺素30毫秒，我们通过计算对照验证了相位同步性的组间差异并非由该滞后引起：将乙酰胆碱信号前移30毫秒后，成功与失败试验间仍存在显著相位同步性差异，且该差异在蓝斑神经元抑制后消失（附图7a）。
图4. 前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性是抑制控制行为的稳健指标
a) 相位同步性计算示意图
b) 生理盐水与CNO处理下成功/失败试验的神经递质相位分布
c) 两种处理条件下行为结果前的相位同步性
d) 成功/失败试验行为结果前的相位同步性轨迹
e) 成功/失败试验行为结果前的平均相位同步性
f) 相位同步性ROC曲线下面积对比
g) 相位同步性组间差异与行为表现的相关性（盐水组正相关，CNO组无关联）
h) 行为结果前相位转换速率对比
i) 成功/失败试验的平均相位转换速率
（图c-h数据来自5只动物的34次盐水记录和42次CNO记录；图i包含5只动物76次记录）
成功与失败试验间的去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性差异与行为表现呈正相关，且该相关性在CNO抑制基底前脑投射的蓝斑神经元后消失（图4g，附图7b），表明前额叶皮层中两种神经递质的交互作用与抑制控制存在稳定关联。虽然失败试验中的平均相位同步性通常较弱，我们进一步探究了相位同步性的其他行为相关特征。研究发现相位同步性呈非均匀分布，且明显偏向数值1，说明去甲肾上腺素与乙酰胆碱活动多数时间处于同相状态（图4d插图）。细致观察发现相位同步性会偶尔快速下降至0附近，表明去甲肾上腺素能与胆碱能系统会短暂进入反相状态（图4a下二栏）。尽管这种瞬时反相机制尚未明确，我们检测了相位状态转换是否与行为相关。通过评估行为结果前的状态转换次数，发现成功与失败试验在行为结果前约3秒开始出现转换率的显著差异（图4h）。更重要的是，与对行为表现的影响一致，CNO抑制蓝斑神经元显著降低了成功与失败试验间的转换率差异（图4i）。在所有19只记录动物中，成功与失败试验的转换率差异与行为表现呈正相关（附图7c）。
05.抑制胆碱能向蓝斑的投射不影响前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性与抑制控制
鉴于抑制基底前脑投射的蓝斑神经元会显著破坏抑制控制及行为依赖的相位同步性，我们进一步探究基底前脑向蓝斑的投射是否具有类似作用。通过在ChAT-Cre小鼠蓝斑区注射逆向AAV病毒，在投射至蓝斑的胆碱能神经元中表达抑制性DREADD受体（附图8a）。免疫组化分析显示小脑上脚/红核、脑桥网状核及三叉神经运动核区有mCherry荧光蛋白表达（附图8b），但在基底前脑区未观察到明显表达。抑制胆碱能向蓝斑的投射并未影响抑制控制表现（附图8c），但成功试验中小鼠获取水滴奖励的反应时间显著延缓（附图8d），表明该操作影响了运动功能而非认知功能。
与DBh-Cre小鼠中操控蓝斑-去甲肾上腺素系统的结果类似，操控胆碱能向蓝斑的投射并未消除前额叶神经递质信号在成功与失败试验间的差异（附图8e）。与行为结果一致，抑制该投射通路未调节去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性（附图8f），也未显著改变相位状态转换率——CNO处理组与盐水对照组中失败试验的转换率均高于成功试验（附图8g）。这些结果进一步支持前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性与抑制控制存在特异性关联。
06.投射至前额叶皮层与基底前脑的蓝斑神经元存在不同亚群
实验数据表明，抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元会显著损害抑制控制行为并破坏相位同步性，但对前额叶去甲肾上腺素振幅影响有限。这提示投射至基底前脑与前额叶皮层的蓝斑神经元可能分属不同亚群。为验证该假设，我们在DBh-Cre小鼠中进行AAV介导的Cre依赖性双色逆向追踪实验，同时在前额叶皮层眶额区注射AAVrg-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry（或EYFP），在基底前脑注射AAVrg-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP（或mCherry）（图5a）。注射3-4周后对蓝斑进行脑切片免疫组学分析，定量表达mCherry、EYFP或双标信号的蓝斑神经元数量（图5b,c）。沿前-后轴分析发现，投射至眶额区的蓝斑神经元遍布整个蓝斑，但其密度最高处位于蓝斑起始端后约250微米（图5d）；而投射至基底前脑的神经元沿前-后轴分布相对均匀（图5d）。双向投射神经元也呈现类似分布模式（图5d）。
图5. 逆向追踪揭示投射至前额叶皮层与基底前脑的蓝斑神经元亚群
a) 蓝斑神经元中不同荧光蛋白的逆向表达示意图
b) 共表达EYFP（伪绿色）与mCherry的蓝斑神经元共聚焦图像示例
c) 示例小鼠蓝斑切片显示眶额区与基底前脑投射神经元的空间分布
d) 沿前-后轴分布的蓝斑神经元定量分析
e) 投射至眶额区、基底前脑或双向投射的蓝斑神经元整体量化（示意图显示各亚群占比）
在每个蓝斑切片中，投射至眶额区与基底前脑的蓝斑神经元主要分布于蓝斑背侧。这两类神经元亚群相互混杂，形成"椒盐分布"模式（图5c）。总体来看，投射至眶额区的蓝斑神经元数量与投射至基底前脑的神经元数量相当（图5e），各约占蓝斑神经元总数的15%。而同时向前额叶皮层与基底前脑投射的神经元仅占眶额区或基底前脑投射神经元的约30%（图5e）。
07.抑制控制期间前额叶群体神经元活动
前期研究已证实前额叶皮层在抑制控制中的关键作用。在发现前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性这一行为相关神经调节特征后，我们进一步探究其对介导抑制控制的前额叶神经活动的潜在影响。通过在前额叶植入Neuropixels探针记录群体神经元活动，同时化学遗传抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元（图6a）。抑制控制过程中活跃的神经元（放电频率>1赫兹）分布于前额叶皮层多个亚区，包括眶额区和前边缘皮层，提示这些亚区共同参与抑制控制。其中17%的神经元呈现窄波形特征（快放电单元），其余为宽波形常规放电单元（图6b）。两类神经元沿探针呈均匀分布，覆盖电极尖端约1.1毫米范围。与生物传感器组结果一致，抑制基底前脑投射的蓝斑神经元显著损害小鼠的抑制控制表现（图6c）。此外，DCZ处理期间前额叶神经元在抑制控制过程中的放电频率降低，证实蓝斑对前额叶活动具有调节作用（图6d）。DCZ介导的蓝斑神经元抑制对抑制提示音出现时的前额叶群体放电频率仅产生轻微影响（附图9）。
图6. 抑制控制期间前额叶皮层Neuropixels记录
a) Neuropixels探针在前额叶定位的组织学验证（红色染料与黄色箭头标示）
b) 常规放电单元与快放电单元的波形特征（左图）及其沿探针的分布位置（右图）
c) DCZ介导的化学遗传抑制使抑制控制表现降至随机水平
d) 生理盐水与DCZ处理下成功/失败试验行为结果前的群体放电频率（插图为平均放电频率）
e) 两种处理条件下的编码神经元数量
f) 神经元总数对比
g) 示例编码神经元在成功/失败试验中的放电点阵图
h) 编码神经元在行为结果前的群体放电轨迹（饼图显示成功试验中高放电与低放电编码神经元占比；插图为编码神经元沿探针分布）
i) 示例动作预测神经元在成功/失败试验中的放电点阵图
j) 动作预测神经元在行为结果前的群体放电轨迹（左插图为神经元分布；右插图为平均放电频率）
k) 动作预测神经元占比对比
l) 动作预测神经元中编码神经元数量对比
（所有Neuropixels数据来自3只动物的15次盐水记录和15次DCZ记录）
在生理盐水对照组中，与既往研究一致，我们发现部分神经元对抑制控制进行编码，其成功与失败试验间的放电频率存在显著差异（图6e-h，附图10），因此将这些神经元定义为编码神经元。这些编码神经元均匀分布于眶额皮层各层（图6h插图）。然而，抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元后，编码神经元数量减少（图6e），该现象并非源于DCZ处理期间神经元总数下降，因为两组记录的神经元总数无显著变化（图6f）。虽然蓝斑神经元抑制降低了编码神经元的放电频率，但未改变成功试验中高放电与低放电编码神经元的比例（图6h）。
我们还发现一小部分神经元在失败试验中行动前突然升高放电频率，因此将其定义为动作预测神经元（图6i,j）。这类神经元主要分布于眶额皮层浅层（图6j插图）。与编码神经元相反，抑制蓝斑神经元既未改变动作预测神经元的放电频率，也未影响其占比（图6k）。此外，同时具有动作预测与编码特性的神经元极少，且该重叠群体不受蓝斑神经元抑制的影响（图6l）。这些结果表明动作预测神经元不太可能参与冲动性的认知控制。
通过严格阈值（经Bonferroni多重比较校正）识别编码神经元，约26%的神经元被归类于此。但其他神经元也可能以集体方式微弱参与抑制控制。为探究前额叶群体活动如何表征抑制控制，我们首先计算并比较了编码神经元在成功与失败试验中的两两互相关关系。结果显示，抑制蓝斑神经元对编码神经元相关结构的破坏程度显著高于非编码神经元（图7a,b），表明去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性对编码神经元具有更强调控作用。
图7. 前额叶皮层编码抑制控制的群体放电模式
a) 编码神经元两两互相关图
b) 非编码神经元两两互相关图
c) 群体放电模式在dPC1、dPC2、dPC3维度上的投影（左：盐水对照组；右：DCZ处理组）
d) 低维空间中表征抑制控制的群体放电模式（左：盐水对照组；右：DCZ处理组）
e) 成功与失败试验群体放电模式的簇间距离对比
f) 簇间距离与行为表现的相关性（盐水组正相关，DCZ组无关联）
（所有Neuropixels数据来自3只动物的15次盐水记录和15次DCZ记录）
为验证这一发现，我们采用解混主成分分析对抑制控制相关与独立成分的群体动力学进行分解。结果显示，在dPC1、dPC2和dPC3维度上，成功与失败试验的抑制控制相关群体放电模式投影存在显著差异，而独立成分则无此差异（图7c）。通过计算成功与失败试验群体放电动力学在低维dPCA空间中的距离，发现该距离与行为表现呈正比（图7d-f）。为检验非编码神经元是否参与抑制控制的群体放电动力学，我们分别对编码神经元与非编码神经元进行dPCA分析。仅使用编码神经元计算的群体放电动力学距离显著小于使用全部神经元的结果（附图11），提示非编码神经元也可能参与抑制控制。正如预期，抑制蓝斑神经元显著减小了成功与失败试验群体放电模式间的距离（图7e），并破坏了其与行为表现的相关性（图7f）。这些结果表明前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱交互作用通过调节群体神经元活动介导抑制控制。
08.瞳孔动态反映失败试验中的去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性
鉴于既往研究证实蓝斑活动与瞳孔扩张的因果关系，以及瞳孔尺寸与皮层去甲肾上腺素/乙酰胆碱活动的相关性，我们进一步探究抑制控制中瞳孔尺寸与神经递质及其相位同步性的定量关系。分析行为结果前抑制音期间的瞳孔动态，发现除失败试验中舔吸前约0.5秒出现瞳孔扩张外，成功与失败试验间无显著差异（图8a）。基于相位同步性的组间差异，我们推测瞳孔尺寸与相位同步性的关系可能受行为结果调节。通过系统辨识方法评估神经信号到瞳孔尺寸的时间响应函数，发现成功与失败试验中去甲肾上腺素/乙酰胆碱信号到瞳孔的映射关系无显著差异（图8c）。有趣的是，失败试验中相位同步性到瞳孔的映射关系与神经递质信号类似，而成功试验中的映射函数趋近于零（图8d），表明相位同步性对瞳孔尺寸的影响在失败试验中更为显著。为确认该差异与抑制控制的特异性关联，我们进一步分析自由期的映射关系，发现成功与失败试验的相位同步性映射函数无显著差异（附图12a），去甲肾上腺素/乙酰胆碱的映射函数也无组间差异（附图12b），且其振幅远低于抑制控制期。
图8. 去甲肾上腺素/乙酰胆碱相位同步性与瞳孔尺寸的关系
a) 抑制控制任务中行为结果前的瞳孔动态（19只动物111次记录）
b) 神经信号到瞳孔尺寸的时间响应函数辨识流程
c) 成功与失败试验中前额叶神经递质到瞳孔的映射函数无显著差异
d) 失败试验中相位同步性到瞳孔的映射函数显著强于成功试验
（图c-d数据来自19只动物111次记录）
三、讨论
本研究系统探究了去甲肾上腺素能与胆碱能系统协同活动对冲动控制的影响。尽管学界长期推测这两种神经调节系统通过协同作用调控脑功能，但其交互作用如何影响神经功能与行为仍不明确。通过光纤光度记录神经递质动态与Neuropixels记录前额叶群体神经元活动，我们的研究首次提供直接实验证据，表明去甲肾上腺素与乙酰胆碱信号的相位同步性是一种重要的神经调节特征，标志着两种系统对介导冲动行为抑制控制的前额叶神经活动产生了协同调控。
研究发现小鼠的冲动舔吸行为具有习惯性特征，可能由糖水奖励强化形成。而抑制冲动舔吸则是涉及认知控制的习得性行为，训练期间成功率的提升印证了这一观点（附图2a）。这种现象符合抑制性学习理论，即个体需要学习在特定条件下抑制不会产生预期结果的行为（如红灯时不过马路）。缺水 rodents 对出水口的冲动舔吸行为已被广泛记录，常被用于研究冲动性的神经基础。冲动性具有多维度特性，可表现为情境不适或过早执行的行为，常导致不良后果。其中运动抑制缺陷（冲动行为）可表现为无法在特定时段抑制运动反应（等待冲动性），或无法中止已发起的运动反应（终止冲动性）。其他形式的冲动性则与决策缺陷相关，包括证据积累不足或倾向于选择即时小奖励而非延迟大奖励（冲动选择）。不同行为范式被用于评估这些冲动性表现：概率折扣任务与时间折扣任务主要考察冲动选择，而停止信号反应时任务与五选择序列反应时任务则用于检测冲动行为。本研究任务专门评估等待冲动性的认知控制，与五选择序列反应时任务同时测量等待冲动性和注意能力不同。我们聚焦于前额叶对等待冲动性的抑制控制，与Narayanan和Laubach采用的延迟反应任务具有相似性。前额叶皮层失活的功能缺失结果验证了既往发现：大鼠前额叶皮层被muscimol失活后冲动性显著增加，强调了该脑区在冲动行为认知控制中的关键作用。
研究发现前额叶部分神经元通过放电频率在成功与失败试验间的差异对抑制控制行为结果进行编码，这与既往关于投射特异性前额叶神经元在抑制控制中呈现不同激活模式的报道一致。值得注意的是，这些编码神经元均匀分布于内侧前额叶与眶额皮层，提示两个脑区共同参与行为抑制。这与先前关于相同行为变量同时被两个脑区编码的研究相符。令人困惑的是，抑制蓝斑神经元虽改变了编码神经元数量，却未影响其放电频率的组间差异（附图10）。但通过dPCA整合所有神经元放电模式的分析显示，成功与失败试验间抑制控制相关群体动力学的差异确实与行为表现相关。更重要的是，蓝斑神经元抑制削弱了低维空间中两种行为结果对应的群体放电模式差异（图7e），表明前额叶皮层存在抑制控制的群体编码机制。这一发现为后续研究前额叶不同亚区群体神经元如何介导抑制控制提供了新方向。
既往药理学研究强调了去甲肾上腺素能与胆碱能系统协同作用的行为意义。在发育关键期，单独耗竭去甲肾上腺素或乙酰胆碱均不影响皮层眼优势柱发育，但两者同时耗竭会阻碍该过程。α₂肾上腺素能受体激动剂胍法辛的抗抑郁作用可被杏仁核烟碱胆碱能受体β₂亚基敲低所阻断。这种交互作用具有双向性：杏仁核去甲肾上腺素末梢损毁同样会阻断烟碱部分激动剂金雀花碱的抗抑郁效应。通过同步记录大脑神经递质动态，我们的研究为去甲肾上腺素-乙酰胆碱交互重要性提供了新证据。新型生物传感器使我们在行为相关时间尺度上表征这种交互成为可能。数据显示去甲肾上腺素-乙酰胆碱相互作用对行为的影响具有即时性，失败试验中相位同步性在行为结果前约3秒即开始下降。
研究结果表明，去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性（而非单一递质信号）是抑制控制的重要生物标志，凸显了两类系统对脑功能的协同调控。为何相位同步性如此关键？这可能源于去甲肾上腺素能与胆碱能系统在受体水平的交互作用：既往研究报道去甲肾上腺素可抑制胆碱能轴突末梢释放乙酰胆碱；乙酰胆碱对皮层和海马神经元的调节作用取决于去甲肾上腺素水平；反之，乙酰胆碱通过M2毒蕈碱胆碱能受体抑制去甲肾上腺素释放。因此维持两系统平衡对认知功能至关重要。支持这一观点的研究发现，阻断海马胆碱能输入导致的行为记忆缺损可通过降低海马去甲肾上腺素水平得以缓解。这表明当去甲肾上腺素与乙酰胆碱系统处于特定相位关系时，大脑可能处于最佳工作状态。这一机制尤其值得关注，因为肾上腺素能受体与毒蕈碱胆碱能受体均属G蛋白偶联受体，其作用时间常数较慢（数百毫秒至秒级）。在前额叶皮层中，α₂A肾上腺素能受体与M1毒蕈碱胆碱能受体表达最为丰富。α₂A受体的抑制特性与M1受体的兴奋特性可能使前额叶网络对慢波振荡（0.4-0.8赫兹）的相位同步性特别敏感，通过维持兴奋-抑制平衡实现最优认知处理。蓝斑活动的超慢振荡已被证实与睡眠等脑功能相关。我们的数据还显示，在冲动舔吸前3-4秒去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性快速下降，而成功试验中同步性逐渐升高（图4d）。鉴于相位同步性组间差异与抑制控制表现相关（图4g），且前额叶与蓝斑存在双向连接，抑制控制期间相位同步性偏离基线的方向可能反映了蓝斑-前额叶-蓝斑环路的稳定性——这对认知控制至关重要。若果真如此，前额叶去甲肾上腺素-乙酰胆碱相位同步性可能在众多其他认知功能中发挥关键作用。未来研究有必要在清醒行为动物中，从网络、细胞和分子水平深入揭示相位同步性调控群体神经元活动介导多种执行功能的具体机制。
通过向基底前脑区注射逆向AAV病毒，我们在蓝斑神经元中观察到显著的标记信号。功能实验表明，抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元会损害抑制控制能力，并破坏去甲肾上腺素与乙酰胆碱系统之间与行为相关的相位同步性。这些结果为先前关于蓝斑向基底前脑投射的研究提供了新的实验证据。本研究通过利用Cre/Lox系统将荧光标记物表达限定于去甲肾上腺素能神经元，提高了AAV介导的逆向标记特异性，进一步支持了去甲肾上腺素能与胆碱能系统在认知任务中存在交互作用的观点。
然而，在蓝斑区注射逆向AAV病毒后，我们未能在基底前脑区的胆碱能神经元中观察到明显的mCherry表达。考虑到蓝斑区域存在胆碱能轴突，且既往多项逆向/顺向追踪研究均报道基底前脑向蓝斑区的轴突投射，这一结果略显意外。一种可能是蓝斑区观察到的胆碱能轴突并非源自基底前脑的胆碱能神经元。支持这一观点的是，我们在三叉神经运动核、脑桥网状核以及小脑上脚/红核区域观察到mCherry表达与ChAT免疫信号的共定位。既往研究已证实脑桥网状核向蓝斑的投射。尽管这种胆碱能调控蓝斑活动的功能后果尚不明确，但可以解释当DREADD介导的抑制沉默这些运动功能相关核团神经元时出现的反应时间延缓。虽然抑制这些胆碱能神经元未明显破坏抑制控制功能，但这些微环路的结构与功能仍需未来研究深入探索。
尽管未发现基底前脑胆碱能神经元向蓝斑的直接投射，但这不意味着基底前脑对蓝斑活动没有影响。基底前脑胆碱能神经元可能通过间接途径调控蓝斑。除胆碱能神经元外，基底前脑还包含谷氨酸能与GABA能神经元。研究表明，投射至前额叶皮层的基底前脑胆碱能神经元具有广泛的局部侧支，与基底前脑内其他非胆碱能神经元形成突触连接。Agostinelli等人通过Cre依赖性顺向追踪发现，基底前脑谷氨酸能神经元向蓝斑发出稀疏投射，GABA能神经元则发出中等强度投射。因此，基底前脑胆碱能神经元可能通过双突触连接间接影响蓝斑。此外，前额叶皮层主要向基底前脑GABA能神经元（而非胆碱能神经元）发出密集投射。抑制投射至基底前脑的蓝斑神经元导致前额叶群体放电模式差异减小，可能通过去抑制回路增强成功与失败试验间乙酰胆碱水平的差异。而前额叶去甲肾上腺素水平的组间差异未受该操作影响，可能因为前额叶神经元同时投射至蓝斑去甲肾上腺素能神经元及其周围的GABA能神经元。未来采用顺向多突触病毒追踪技术结合多脑区同步记录，将为了解前额叶与蓝斑或基底前脑相互作用的神经环路提供重要见解。
与既往关于蓝斑激活引起瞳孔扩张的因果关系研究一致，我们发现抑制控制期间瞳孔波动与去甲肾上腺素动态呈正相关，同时瞳孔尺寸与乙酰胆碱信号也存在正相关。这可能源于蓝斑活动既激活基底前脑又引起瞳孔扩张，或基底前脑激活与瞳孔尺寸间存在潜在因果关系。研究显示，成功与失败试验中去甲肾上腺素和乙酰胆碱信号与瞳孔尺寸的关系基本一致。但有趣的是，去甲肾上腺素-乙酰胆碱同步性在失败试验中与瞳孔尺寸正相关，在成功试验中则无关联。这表明相位同步性与瞳孔尺寸的关系受行为情境调节，可能被其他认知相关信号门控。既往研究已确立中缝背核相位性激活与瞳孔扩张的因果关系，血清素系统也被认为参与冲动控制。未来研究需要深入探索瞳孔扩张与不同神经调节系统集体活动之间的动态关系。
四、方法
所有实验程序均经哥伦比亚大学动物护理与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院指南进行。实验使用3-7月龄成年小鼠（雄性22只，雌性26只），所有小鼠均饲养于12小时光暗循环环境中。
01.手术操作
动物通过氧气中的异氟烷麻醉（诱导浓度5%，维持浓度2%）后固定于立体定位仪。采用温控加热垫维持体温在36.6°C。在头皮切开前，皮下注射盐酸利多卡因和丁丙诺啡（0.05 mg/kg）确保全程镇痛。手术结束时注射拜有利（5 mg/kg）和酮洛芬（5 mg/kg），术后24小时内追加四次拜有利和两次酮洛芬，连续5天每日至少监测一次体重。
所有腺相关病毒注射前，通过调整使动物头部保持水平（两侧头皮z坐标误差≤0.04 mm，人字缝与前囟z坐标误差≤0.06 mm）。钻取靶向脑区骨窗后，各开颅处滴注生理盐水防止脑组织干燥。采用毛细玻璃微管吸取病毒溶液，使用精密注射系统以0.8 nL/s速率注入目标脑区。每次注射后留针至少10分钟再缓慢撤出。
为检测抑制控制中的神经递质动态，将GRABNE与GRABACh病毒分别注射至双侧前额叶皮层（每侧240 nL，每只动物随机分配病毒种类）。为验证半球间信号一致性，在一只小鼠双侧前额叶注射同种GRAB病毒。化学遗传操控实验中：野生型小鼠双侧前额叶注射AAV9-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry；Dbh-Cre或ChAT-Cre小鼠前额叶注射AAVrg-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry；Dbh-Cre小鼠基底前脑区注射逆向AAV调控蓝斑神经元；ChAT-Cre小鼠蓝斑区注射逆向AAV调控胆碱能投射。为进行蓝斑神经元逆向追踪（图5），在Dbh-Cre小鼠同侧前额叶与基底前脑分别注射携带不同荧光标签的逆向AAV追踪病毒。
完成GRAB病毒注射后，在注射点上方约0.15 mm处植入光纤（15只使用200 μm直径/NA=0.39光纤，4只使用100 μm直径/NA=0.22光纤）。双侧光纤以8°侧向角插入前额叶，使用C&B Metabond构建固定头帽与头杆，牙科水泥加固光纤插芯与头板。术后3周待病毒充分表达后进行光纤记录。
Neuropixels探针植入前，先将探针固定于3D打印头帽，探针鞘涂覆DiI溶液用于术后轨迹定位。术前2小时皮下注射地塞米松（2 mg/kg）减轻脑水肿。麻醉并调平头部后，在前额叶区域钻取直径1 mm骨窗（左侧2只，右侧1只），枕叶钻取接地针孔并刮糙颅骨表面。切除硬脑膜后，以20 μm/min速度将探针降至目标深度。植入后骨窗用骨蜡封闭，头帽与头杆用牙科水泥固定，最后将头帽地线连接至接地针。术后至少恢复一周再进行行为训练。
02.化学遗传学失活
将溶解于生理盐水的氯氮平N-氧化物（CNO，1mg/kg）或去氯氯氮平（DCZ，0.02 mg/kg）腹腔注射至相应Cre小鼠，以失活目标区域中表达hM4D(Gi)的神经元。DCZ是比CNO效力更强、代谢更稳定的DREADD激动剂，在研究中后期使用。等量生理盐水作为对照。注射15分钟后开始行为学测试，每只动物的盐水与CNO处理日随机交替进行。
03.组织学分析
研究结束时，经心灌注PBS后立即灌注冰镇4%多聚甲醛。取脑后在4°C下于4%多聚甲醛中固定过夜，随后在4°C的30%蔗糖PBS溶液中脱水3天。脑组织经OCT包埋后，用冰冻切片机切取30μm冠状切片。对于注射EYFP/mCherry逆向追踪病毒的脑组织，从面神经出现至第四脑室最大处（覆盖蓝斑区域，前囟后约5.2-5.9 mm）切取25μm切片。脑切片经PBS清洗4次后，在含10%正常羊血清/驴血清和0.5% Triton X-100的PBS中封闭2小时，随后室温下孵育一抗过夜：鸡源抗GFP（1:500）用于GFP/EYFP检测，鸡源抗酪氨酸羟化酶（TH，1:500），兔源抗多巴胺β羟化酶（Dbh，1:200）及兔源抗胆碱乙酰转移酶（ChAT，1:300）。次日经PBST清洗后室温孵育二抗2小时：Alexa Fluor 488标记羊抗鸡（1:800）用于GFP/EYFP信号增强或TH染色，Alexa Fluor 568标记羊抗大鼠（1:800）用于mCherry增强，Alexa Fluor 647标记羊抗兔（1:500）用于ChAT/Dbh染色。切片经PBST和PBS清洗后，用含DAPI的封片剂封片，通过高通量切片扫描仪（8倍物镜）成像，典型切片经共聚焦显微镜（20倍物镜）进行转盘扫描。
为评估蓝斑神经元中EYFP、mCherry与Dbh的共定位，每张切片在共聚焦显微镜下进行Z-stack和拼贴扫描。根据Dbh信号强度并参照脑图谱，在低倍预扫描图像上手动绘制包含整个蓝斑的感兴趣区，连续无Dbh信号的末端切片被排除分析。通过最大强度投影生成复合图像，使用ImageJ标记荧光阳性胞体轮廓，通过自定义Python脚本提取胞体质心坐标。通过计算标记胞体数量与Dbh阳性胞体总数的比值，得出EYFP、mCherry或双标神经元的密度，最终通过跨动物平均获得各投射亚群的密度数据。
04.行为学任务
行为训练期间小鼠限水，任务中使用含10%蔗糖的甜水作为奖励。每日监测体重，训练后补充水分维持体重，非训练日自由饮水。
实验时头部固定的小鼠置于定制装置的亚克力管中。通过不锈钢给水针管递送奖励，给水针管连接电容触摸传感器检测舔吸行为。由Arduino微控制器生成抑制提示音（4 kHz, 65 dB），经音频放大器驱动置于动物25cm外的扬声器。惩罚气流通过16号不锈钢管递送，置于动物脸颊侧8cm处。行为实验通过基于MATLAB xPC实时系统的自定义程序控制，所有行为数据以1 kHz采样记录。
训练阶段：小鼠先进行水源关联训练，学习在随机间隔（12-22秒均匀分布）的甜水递送时舔吸给水针管，当超过75%的奖励被成功获取时进入第二阶段。第二阶段：每轮试验以自由期开始（5-7秒均匀分布），此期间舔吸无惩罚；自由期后播放抑制提示音（2-5秒指数分布，λ=1.5），期间任何舔吸将立即终止提示音并触发三次低强度气流惩罚（10 psi, 20 ms, 200 ms间隔）；若全程抑制舔吸，提示音结束后立即获得甜水奖励（约6 μL）。鉴于啮齿类通常在0.8秒内获取奖励，将奖励后1秒内的舔吸定义为成功试验（使用0.75秒或1.25秒阈值结果一致）。获取奖励超时的试验（占6%）被排除分析。试验间间隔为7-10秒均匀分布。当连续2日成功率>50%时进入完整抑制控制任务。
完整抑制控制任务与第二阶段类似，但采用更长的抑制提示音（5-12秒指数分布，λ=4.5）和更强惩罚（20 psi, 200 ms单次气流）。当连续3日行为表现显著高于随机水平时视为训练达标（详见行为分析部分），未达标个体（N=1）被排除。最终19只动物进行前额叶光纤记录，3只进行Neuropixels记录。
05.Neuropixels记录
使用由SpikeGLX控制的NI Neuropixels记录系统采集探针信号，通过xPC实时系统产生的TTL脉冲与行为装置同步。
06.光纤光度记录与预处理
采用双通道光纤光度系统记录GRABNE和GRABACh传感器的荧光信号。每个传感器的激发光（465 nm和405 nm）由LED产生，通过MiniCube传输。GRABNE和GRABACh的发射荧光由MiniCube内置光电倍增管检测。系统在"锁相"模式下运行，四种激发光强度分别以208.62 Hz、572.21 Hz、333.79 Hz和470.88 Hz频率调制，以避免环境光干扰和通道串扰。经解调的信号通过25 Hz低通滤波后以12 kHz采样率采集。系统通过xPC实时系统产生的TTL脉冲与行为装置同步。所有光度数据经降采样至120 Hz后保存供离线分析。针对抑制控制期间（平均时长7.6秒）的神经递质动态，荧光信号先经0.1 Hz高通滤波去除低频振荡后进行分析。
07.瞳孔测量
使用定制瞳孔测量系统进行记录。相机由xPC实时系统产生的10 Hz TTL脉冲触发，图像实时传输至高速固态硬盘。每个视频片段手动选取初始感兴趣区域，采用DeepLabCut工具箱分割瞳孔轮廓。分别针对800*600像素和1280*1080分辨率视频创建包含450帧和160帧的训练集，每帧手动标记瞳孔周边12个点，通过调整裁剪参数提升训练精度。采用mobilenet_v2_0.75深度网络进行训练，并对所有会话视频进行分析。通过圆形回归拟合自动标记点，基于拟合轮廓计算瞳孔尺寸。随机抽取约5%的分割图像进行质量验证。眨眼期间的瞳孔尺寸通过前后时刻数据插值估算。若超过33%视频帧因质量不佳或眼睑遮挡导致瞳孔轮廓识别失败，则该会话被排除分析。数据分析前对瞳孔尺寸数据施加截止频率3.5 Hz的四阶非因果低通滤波。
08.数据分析
所有分析首先以单个会话为单位进行，再跨会话或动物计算总体平均值与标准误。每个会话的首个试验因需预留实验人员离开时间而被排除。
09.行为分析
为评估抑制控制对冲动舔吸的抑制效果，将实验测得成功率与随机水平成功率进行标准化。通过蒙特卡洛模拟基于动物基线行为确定随机水平成功率：使用当前试验行为结果后7秒至下一试验抑制音开始期间的舔吸时间戳计算基线舔吸间隔分布（排除奖励/惩罚引发的舔吸）。每个模拟试验的抑制音时长从λ=4.5的5-12秒指数分布中抽取，采用估计的基线舔吸间隔分布模拟舔吸序列。若抑制音期间检测到舔吸则记为失败试验，反之为成功试验。每个模拟会话含100次试验，随机水平成功率通过10次模拟会话平均得出。
各动物的标准化行为表现按以下公式计算：
10.反应时间计算
反应时间定义为从水奖励开始（即机会窗口起始）到首次获取奖励的舔吸反应之间的时间间隔，仅针对成功试验进行计算。
11.频谱分析
对各会话的神经递质信号进行Z-score标准化后，采用汉明窗（50%重叠）通过MATLAB内置函数pspectrum计算单边功率谱密度。图1f中的频谱先按0.1 Hz处功率进行会话内标准化，再跨会话平均。
12.相关性分析
为评估去甲肾上腺素与乙酰胆碱信号的相关性，将两者进行带通滤波（0.1-5 Hz）和Z-score标准化。使用MATLAB内置函数xcorr计算各会话信号间的总体互相关（最大滞后10秒）。为专门评估抑制控制期间的关系，提取行为结果前5-1秒的4秒时间窗信号，跨试次计算皮尔逊相关系数。分析瞳孔尺寸与神经递质信号的互相关时，先将神经递质信号低通滤波（5 Hz）后降采样至10 Hz（与瞳孔记录频率一致）。所有信号经Z-score标准化后计算各会话互相关，置信区间通过100次原始信号与打乱信号的互相关计算生成，取分布0.15%与99.85%分位数作为99.7%置信区间。
13.相干性分析
采用改编自Buzsaki实验室的工具箱，通过多锥度方法计算去甲肾上腺素-乙酰胆碱相干性（窗长11秒，重叠5秒，步长6秒，锥度数8，填充0）。使用各记录前1500秒数据计算会话内相干性后跨会话平均。置信区间通过打乱信号的重采样相干性计算估计。
14.瞳孔相位关系
通过将神经递质信号振幅与瞳孔波动典型周期的分箱相位（-180°至180°分为36箱，每箱10°）对齐进行评估。先将瞳孔信号带通滤波（0.1-1 Hz），通过希尔伯特变换计算瞬时相位角，随后统计各相位箱对应的神经递质信号平均值。
15.相位同步性分析
为考察神经递质信号间的瞬时相位同步性，先将各光度信号带通滤波（0.4-0.8 Hz，巴特沃斯二阶滤波器）并Z-score标准化，经希尔伯特变换提取相位角并规整至[-180°,180°]区间。瞬时相位同步性按以下公式计算：
其中𝜑𝑁𝐸(𝑡)和𝜑𝐴𝐶ℎ(𝑡)分别代表去甲肾上腺素与乙酰胆碱的瞬时相位。在后续分析前，采用截止频率4 Hz的二阶非因果低通滤波器对计算所得的相位同步性进行降噪处理。相位同步性值为1表示∣𝜑𝑁𝐸(𝑡)−𝜑𝐴𝐶ℎ(𝑡)∣=0，即两种神经递质振荡处于同相状态；值为0则表示∣𝜑𝑁𝐸(𝑡)−𝜑𝐴𝐶ℎ(𝑡)∣=180°，即两者处于反相状态（图4a）。
为量化去甲肾上腺素-乙酰胆碱从同相转为反相的切换次数，对每场记录的相位同步性进行希尔伯特变换，统计相位包裹点的数量作为切换次数（图4a）。行为结果前的相位同步性采用2秒移动窗口（步长0.5秒）进行平均。切换率的计算先统计2秒窗口内的切换事件数，再通过标准差为0.25的高斯窗进行平滑处理。
16.时间响应函数分析
采用mTRF工具箱通过前向建模将瞳孔尺寸表征为神经信号的卷积响应。模型公式如下：
其中{𝑝}𝑡代表瞳孔尺寸，{𝑠}𝑡代表去甲肾上腺素、乙酰胆碱信号或两者的相位同步性，{𝛽}𝜏代表时间响应函数，{𝜀}𝑡表示模型未能解释的噪声残差。因此，𝛽(𝜏)中的权重值表征了在不同时间滞后𝜏下，神经信号到瞳孔尺寸的转换关系。
通过最小化实测瞳孔轨迹与卷积重建轨迹之间的均方误差来估计时间响应函数权重，并采用吉洪诺夫正则化方法防止过拟合。
其中𝛃表示时间响应函数权重向量，𝐏代表瞳孔尺寸轨迹向量，𝐒为包含时滞神经信号的设计矩阵，𝐈为单位矩阵，𝜆为正则化参数。通过留一交叉验证确定最优𝜆值：计算不同𝜆值对应的均方误差跨折叠平均值，最终采用对应最小均方误差的参数获取当前试次的𝛃估计值。
抑制控制期间的时间响应函数估计选取从抑制音开始到行为结果出现的时段；无舔吸期间的分析则使用试验开始前5秒至抑制音开始的时段。各会话的时间响应函数通过对两种行为结果类型的所有试次权重取平均获得。
17.区分度分析
采用信号检测论与机器学习算法评估失败与成功试验相关生理信号的区分度。对各会话行为结果前3-1秒的2秒时间窗内神经递质信号进行ROC分析：在每个时间点构建失败与成功试验的信号分布，基于分布生成ROC曲线。该曲线通过以下两个概率表征区分能力：
为评估整体区分度，计算各时间点的ROC曲线下面积，并跨会话进行平均（共240个时间点）。同时采用支持向量机评估生理信号对两种行为结果的区分能力：直接以相同2秒时段内的神经递质轨迹作为输入，行为结果作为试次标签。各会话通过10折交叉验证训练和测试SVM分类器，使用平衡准确率量化分类性能以应对可能的类别不平衡：
18.Neuropixels数据分析
使用KiloSort 3自动检测各记录场次的电生理信号中的锋电位，剔除自动排序标记为"噪声"的单元。通过开源软件Phy对锋电位数据进行人工校验，仅保留自动排序与人工校验均标记为"优质"的单元用于后续分析。为区分常规放电单元与快放电单元，选取动作电位波形中后超极化峰值的半峰全宽和波谷至峰值时长作为特征参数，在二维特征平面进行高斯混合模型硬聚类。
由于关注与冲动性认知控制相关的神经元，仅分析在抑制控制任务中活跃（放电频率>1 Hz）的神经元。编码细胞定义为成功与失败试验间放电频率存在显著差异的神经元，其余为非编码细胞。差异显著性采用配对统计检验，p值阈值经Bonferroni多重比较校正（0.05/会话总细胞数）。动作预测细胞定义为在失败试验中行为结果（舔吸）前0.3秒内放电频率超过均值2个标准差的神经元。
为探究抑制控制期间前额叶神经元的相关结构，使用行为结果前5秒内的锋电位记录计算互相关图。通过平均所有细胞对的互相关图获得成对互相关图，再从中减去通过随机打乱试次中细胞对锋电位计算的打乱互相关图。该打乱过程重复100次以估计最终经打乱校正的互相关图。
19.解混主成分分析
为表征行为结果前前额叶神经元群体活动结构，采用解混主成分分析方法。该方法相比传统主成分分析的优势在于，分解得到的主成分能最大程度捕捉任务相关变量解释的神经群体活动方差。本研究中将原始群体神经活动分解为以下边际化分量：
其中𝐗是一个𝖭×𝖣×𝖳×𝖪矩阵，包含使用100毫秒时间窗计算的各试次行为结果前1至5秒内单个神经元的放电频率。𝖭代表活跃神经元数量，𝖣代表抑制控制结果类型数，𝖳代表时间点数，𝖪代表试次数（对于试次数较少的结果类型，空条目用NaN填充）。𝐗𝑡对应时间效应（图6c中的独立成分），其𝖭×𝖳条目被复制𝖣×𝖪次。𝐗𝑡𝑑对应认知控制效应（图6c中的抑制控制成分），其𝖭×𝖳×𝖣条目被复制𝖪次。𝐗noise表示噪声分量。损失函数定义如下：
其中𝐗𝜙表示特定分解分量，𝐅𝜙和𝐃𝜙分别对应该分解的编码器和解码器矩阵。
使用dPCA工具包中的函数编写自定义脚本进行解混主成分分析，所有参数均采用默认设置。对每个会话计算总共20个解混主成分（若神经元数量少于20则取实际数量，如前额叶神经元亚群中的非编码与编码神经元），保留"独立成分"和"抑制控制成分"分解中排名前三的主成分。将群体放电活动投影到相应的解混主成分解码轴，所得投影值跨会话平均。为量化不同结果试次间神经群体动力学的差异，计算成功与失败试验前群体动力学在马氏空间中的距离。为在解混主成分空间可视化会话水平的群体动力学轨迹，沿各主成分轴的投影轨迹使用500毫秒移动窗进行平滑处理（此平滑仅用于可视化，不参与定量分析）。
20.统计方法
所有统计检验均采用双侧检验。在进行统计检验前使用单样本Kolmogorov-Smirnov检验评估数据正态性。若样本符合正态分布，则使用配对或非配对t检验；否则，非配对样本采用Mann-Whitney U检验，配对样本采用Wilcoxon符号秩检验。多重比较使用Bonferroni校正。未采用统计方法预先确定样本量，但本研究样本量与既往报道相当，符合领域常规标准。抑制音时长随机化及模拟均通过MATLAB随机数生成器实现。数据收集与分析过程未对实验条件设置盲法。
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